Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / Материалы Международных чтений, посвященных 100-летию со дня рождения члена-коррес-пондента АН СССР, академика АН АрмССР Э.А.Асратяна.

Влияние ксенотрансплантации нейральных стволовых клеток человека на выработку условного рефлекса двустороннего избегания у крыс-реципиентов

Нейральные стволовые/прогениторные клетки представляют большой интерес в плане использования их как источника материала для заместительной трансплантации при различных дегенеративных заболеваниях ЦНС. В данной работе мы исследовали приживление и развитие стволовых/прогениторных клеток эмбрионального мозга человека, трансплантированных в область гиппокампа крыс линии Вистар, подвергнутых гипоксической гипоксии (ГГ), а также их влияние на выработку условного рефлекса двустороннего избегания (УРДИ).

В работе было использовано три группы животных: подвергнутых гипоксии – n=5 (группа ГГ), подвергнутых гипоксии + трансплантация клеток – n=7 (группа ГГ+Т) и подвергнутых гипоксии + инъекция физиологического раствора – n=6 (группа ГГ+ФР). Гипоксию производили следующим образом: крыс помещали под стеклянный колпак, в течение минуты в такой барокамере понижали атмосферное давление до 180 мм рт. ст. Под этим давлением крыс выдерживали 3 мин, в течение которых у них возникали клонические судороги. Значительная часть крыс (30 %) погибала. Выжившим крысам в течение 30 с под колпак впускали воздух, восстанавливая нормальное атмосферное давление. Выбранная модель гипоксии позволяет получить диффузную массовую дистрофию нейронов головного мозга у крыс, что до известной степени сходно с тем, что наблюдается при некоторых неврологических и психических заболеваниях у людей. Через сутки после гипоксии крысам проводили трансплантацию клеток или инъекцию физиологического раствора. Стволовые клетки  мозга 9.5-недельных эмбрионов человека, полученных в результате медицинского аборта, выращивали в суспензионной культуре в течение 60 дней в среде NPBM (Clonetics) с добавками ростовых факторов,  включающими  hFGF, hEGF и LIF. Трансплантацию (инъекцию физиологического раствора) проводили стереотаксически. Суспензию клеток объемом 3 мкл (физиологический раствор 3 мкл) с концентрацией 500 тыс. клеток/мкл вводили микрошприцем в область гиппокампа по координатам 3.5 мм от брегмы и 2,1 мм латерально на глубину 4 мм. После сеанса гипоксии у всех крыс проводили выработку УРДИ по общепринятой методике на 4-й день (1-й тест), а проверку его состояния на 9-й и 23-й дни (2-й и 3-й тесты соответственно). Степень способности крыс к выработке УРДИ оценивали в баллах от 1 до 8 по разработанной нами шкале (Лосева с соавт., 2002). Критерий выработки рефлекса - 10 реакций избегания удара тока подряд в ответ на тон, что соответствует оценке от 5 до 8 баллов в зависимости от скорости выработки. Для каждой группы крыс  мы объединили показатели всех трех тестов и вычисляли средний балл. Статистическое сравнение между группами проводили по t-критерию для независимых признаков, используя программу STATISTICA.

Через 27 дней после ГГ животных перфузировали 4% параформом на 0.

1 М фосфатном буфере, мозг извлекали, срезы толщиной 20-40 мкм получали на замораживающем микротоме. Препараты исследовали гистологическими (Ниссль и Гимза) и иммуногистохимическими методами с использованием антител против Human Nestin, Human Nuclei, GFAP, III-beta-Tubulin, Vimentin.

Было установлено положительное воздействие нейральных стволовых клеток  человека на поведение  крыс после ГГ. Так, способность к выработке УРДИ у крыс из группы ГГ+Т была выше, чем из групп ГГ+ФР и ГГ. При этом разница была статистически значима по сравнению с группой ГГ+ФР (р=0.012), а по сравнению с группой ГГ наблюдалась та же тенденция (р=0.088). При этом разницы между обеими контрольными группами с ГГ без трансплантатов обнаружено не было (р=0.26).

 У всех животных (кроме одного) были обнаружены трансплантаты в гиппокампе или таламусе. Окраска антителами на human nuclei показала, что клетки человека переживают в мозге крыс в течение всего срока наблюдения (27 дней). Значительная часть клеток дифференцировалась в нейроны, что было выявлено антителами к III-beta-Tubulin. Часть клеток трансплантатов экспрессировали нестин – маркерный белок нейральных стволовых клеток, что свидетельствует о сохранении недифференцированных стволовых клеток.

Таким образом, введение нейральных стволовых клеток в гиппокамп крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии, улучшает их способность  к выработке УРДИ. При этом клетки переживают в мозге реципиентов в течение всего срока наблюдения.