Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VII Междисциплинарная конференция по биологической психиатрии «Cтресс и поведение»

Центральное действие субстанции р на метаболизм дофамина в прилежащем ядре мозга крыс по данным микродиализа

Общим признаком состояния отмены при разных видах наркомании является редуцированное содержание дофамина (ДА) в проекциях мезокортиколимбической системы [4]. Поэтому перспективен поиск фармакологических агентов, которые помимо прямого стимулирующего влияния на ДА-ергическую систему оказывали бы долгосрочный эффект, восстанавливая ее функциональные возможности. Субстанция Р (SP) является основным представителем семейства нейрокининовых пептидов в нервной системе млекопитающих. Участие SP и других нейрокининов в механизмах мотивационного поведения демонстрировалось на моделях самовведения различных аддиктивных веществ, ввключая алкоголь [3]. SP снижает потребление алкоголя как при центральном, так и периферическом введении [1, 2]. Предполагается, что подобные свойства определяются тесной связью с мезокортиколимбической системой мозга, ДА-ергические нейроны которой имеют рецепторы для SP [1] или наличием у последней собственной подкрепляющей активности. SP и нейрокининовые рецепторы широко представлены в ряде мозговых структур, непосредственно связанных с эмоциональными реакциями, таких как миндалина, гиппокамп, передняя поясная извилина. У SP предполагается наличие свойств нейротрофического фактора в отношении ДА-ергических нейронов [2]. Влияние различных агентов на метаболизм ДА оценивают как традиционными способами, измеряя суммарное содержание нейромедиатора в ткани и уровень его метаболитов, так и методом микродиализа in vivo [5]. Имеющиеся в литературе данные по микродиализу, касающиеся влияния SP на ДА-ергическую систему, получены в основном при периферическом или внутриструктурном введении нейропептида. В первом случае не исключены опосредованные эффекты, поскольку SP обладает выраженным периферическим действием, во втором отсутствует целостная картина центральных эффектов. Целью настоящего исследования явилось определение активности ДА-ергической мезолимбической системы мозга при интравентрикулярном введении субстанции P свободно подвижным животным с использованием метода микродиализа.

Методика. В эксперименте было использовано 6 крыс-самцов породы Вистар. Всем животным под нембуталовым наркозом были имплантированы канюли в правый желудочек мозга (AP=-0.9; L=1.4; H=3.5). Одновременно с этим в прилежащее ядро (AP=2; L=1.5; H=7) были введены микродиализные канюли для определения состава внеклеточной жидкости. После закрепления корпуса канюли на голове животного посредством акрилоксида животные помещались в индивидуальные клетки. Микродиализные канюли имели концентрическую конструкцию, которая по сравнению с другими типами подобных устройств обеспечивает наименьшее повреждение ткани мозга. Они были изготовлены из полой диализной мембраны (Hospal, Франция) с внешним диаметром 300 мкм и молекулярным порогом 20 кДа, которая при помощи эпоксидного клея фиксировалась внутри стальной трубки (диаметр 500 мкм) так, что длина свободного участка мембраны составляла 2.5 мм. Микродиализное исследование проводили спустя 48 ч. после операции. До проведения микродиализа животное пребывало в экспериментальной камере для ознакомления с обстановкой. Во время эксперимента приводящая линия канюли присоединялась к шприцу объемом 1 мл, содержащему модифицированный раствор Рингера. Посредством насоса высокой точности раствор поступал в микродиализную канюлю с постоянной объемной скоростью 2.5 мкл/мин. Отводящая линия канюли погружалась в микропробирку объемом 500 мкл, содержащую 5 мкл хлорной кислоты в качестве консерванта. Сбор диализата осуществляли в течение 25 мин., затем пробирку с диализатом заменяли следующей и немедленно помещали в жидкий азот. SP вводили в боковой желудочек мозга за 5 мин до завершения сбора 4-й пробы диализата. В течение 3-х дней каждому животному последовательно вводили: в 1-й день – физиологический раствор, во 2-й день – 0.1 мкг субстанции Р, растворенной в 5 мкл физиологического раствора, в 3-й день – 1 мкг субстанции P. Введение производили с помощью микродозатора в течение 1.5 мин. После этого проводили сбор еще 4-х диализных проб. До проведения анализа пробы хранили при температуре -70^оС. Определение содержания ДА, диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК) в пробах диализата проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. 40 мкл диализата из каждой пробы вводили в хроматографическую систему без предварительной обработки. Положение микродиализных канюль в структурах мозга верифицировали морфологически. Обработку данных проводили, используя дисперсионный анализ ANOVA, в котором факторами служили время и фармакологическое воздействие. За базальный уровень (100%) принималось усредненное содержание медиатора или метаболитов в 3-х пробах, собранных непосредственно перед введением препарата.

Результаты исследования и их обсуждение. Базовое содержание ДА в прилежащем ядре составляло 4.56±0.35 пг, ДОФУК – 236±17.9 пг, ГВК – 203±12.4 пг в пересчете на 10 мкл пробы. Центральное введение SP в дозе 1 и 0.1 мкг вызвало повышение содержания ДА в прилежащем ядре на 71% и 41%, соответственно. При этом не только выраженность, но и динамика изменений зависела от концентрации препарата. При введении 1 мкг SP наблюдалось повышение уровня ДА через 50 мин. Через 75 мин. после введения субстанции Р уровень ДА все еще оставался достоверно повышенным. При использовании 0.1 мкг нейропептида признаки изменения содержания ДА отмечены лишь в пробах, собранных спустя 75 мин. Реакция со стороны метаболитов ДА также зависела от дозы. При дозе 1 мкг уровень ДОФУК повышался на 28%, введение нейропептида в дозе 0.1 мкг не вызвало изменений в содержании этого метаболита. Обе использованные дозы субстанции Р не оказали влияния на содержание ГВК.

Изменение уровня ДА и метаболитов в прилежащем ядре при введении SP в желудочки мозга свидетельствует об участии мезолимбической системы в эффектах нейропептида. Полученные данные позволяют судить об относительном содержании исследуемых соединений. Расчет абсолютной концентрации медиатора в той или иной структуре мозга на основании его концентрации в диализате затруднен рядом обстоятельств. К ним в первую очередь относятся особенности процессов диффузии в мозговой ткани. Моделированию диффузионных характеристик ткани мозга и расчету зависимости процессов трансмембранного переноса от геометрии поверхности и материала мембраны посвящено множество работ. Зависимость темпов наступления изменений от дозы можно объяснить медленной диффузией пептида через экстраклеточное пространство [5], при этом время необходимое для достижения эффективной концентрации в области рецепторов обратно пропорционально введенной дозе субстанции Р. Активация мезолимбической системы, вероятно, связана с непосредственным воздействием пептида на нейрокининовые рецепторы вентральной тегментальной области. Расположенные здесь ДА-ергические нейроны экспрессируют на своей поверхности рецепторы для нейрокининов первого и третьего типов (NK-1 и NK-3), которые в активированном состоянии усиливают частоту разрядов и синаптический выброс дофамина [5]. Хотя SP является специфическим лигандом NK-1 рецепторов, показана ее активность в отношении рецепторов NK-3 типа, воздействием на которые также может объясняться усиленное выделение ДА. Введение субстанции P в область вентрального паллидума приводит к усилению выделения ДА в прилежащем ядре [2]. Кроме того, такое воздействие способно вызывать условную реакцию предпочтения места, причем подкрепляющее действие SP опосредовано NK-1 рецепторами [5]. Не исключено, что вентральный паллидум принимает участие в ДА-позитивных эффектах нейропептида и при интравентрикулярном введении. Способность COOH-концевых фрагментов SP проявлять подкрепляющие свойства и стимулировать выделение ДА неоднократно демонстрировалась в эксперименте. Быстрое расщепление SP на биологически активные фрагменты пептидазами экстраклеточного пространства [3] предполагает немаловажное значение таких фрагментов для наблюдаемых изменений уровня ДА-ергической передачи. С другой стороны, реализация подкрепляющих свойств SP может не ограничиваться ДА-ергическими механизмами. Опиоидная система мозга задействована в некоторых эффектах нейрокининов, в частности блокада опиатных рецепторов ингибирует развитие условной реакции предпочтения места на введение SP [2]. Таким образом, при введении SP в латеральный желудочек мозга наблюдалось повышение содержания ДА и его метаболита ДОФУК в области прилежащего ядра. Время наступления и выраженность повышения зависели от дозы нейропептида.