Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VII Междисциплинарная конференция по биологической психиатрии «Cтресс и поведение»

Эффект новизны на экстраклеточное содержание дофамина в прилежащем ядре мозга крыс с различным индивидуальным опытом, измеренное методом микродиализа на свободно подвижных животных

Социальная изоляция животных от сородичей в раннем онтогенезе приводит к изменению реактивности их нервной системы. Это проявляется повышением двигательной и исследовательской активности, появлением элементов стереотипий и персевераций, повышением чувствительности рецепторов дофамина (ДА) к действию агонистов и антагонистов [5]. Ограничение социального опыта является фактором, способствующим формированию зависимости от психостимуляторов и других психоактивных средств [2.3]. Нами [1-4] доказано, что при социальной изоляции происходит только временное повышение чувствительности ДА-ергической системы с последующим ее функциональным истощением. До настоящего времени нейрохимические механизмы, ответственные за эти особенности, изучены недостаточно. Учитывая тесную связь ДА-ергических систем мозга с исследовательским поведением и стрессом [2.4], было изучено влияние новизны на уровень ДА в проекциях мезолимбической системы мозга при помощи метода микродиализа in vivo. Метод определения экстраклеточного содержания ДА в мозгу крыс с помощью микродиализа in vivo основан на способности биологических молекул диффундировать через полупроницаемую мембрану, расположенную в исследуемой структуре мозга, по концентрационному градиенту. Непрерывный поток растворителя, движущийся по другую сторону мембраны, обогащается компонентами внеклеточной среды и собирается в объеме, удовлетворяющем требованиям аналитической техники. Концентрация интересующего соединения в определенной фракции отражает его относительное содержание в структуре мозга в момент сбора данной фракции.

Методика. В опыте использовано 12 крыс самцов Вистар массой 250-350 г. Половина из них была подвергнута процедуре ранней социальной изоляции, другая половина, выращенных в сообществе, служили контролем. Животных содержали при свободном доступе к пище и воде в условиях инвертированного света с 6.00 до 18.00. Выращивание крыс в условиях социальной изоляции. Животных помещали в индивидуальные клетки с 17-го дня после рождения, когда они становились способными к самообеспечению. В изоляции крысы находились до 100-120 дней. Именно такой период постнатального развития считается наиболее значимым для влияния различных воздействий внешней среды на формирование адаптивного поведения у крыс [1.4]. К началу опыта возраст животных-изолянтов и сгруппированных крыс был одинаков (100-120 дней). После каждого опыта крысы-изолянты помещались в свои индивидуальные клетки. Исследование поведения. В качестве оценки эффекта на новизну использовали помещение животного из места содержания в экспериментальную установку. Установка представляла собой стеклянную полусферу диаметром 30 см. Забор диализата производили у крысы в клетке содержания, а в дальнейшем в стеклянной полусфере с интервалами в 25 мин. Стереотаксическая процедура. Под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) всем животным имплантировали стандартные микродиализные канюли CMA/10 (Швеция) с длиной мембраны 2.5 мм в прилежащее ядро согласно следующим координатам: АР=2.0; SD=1.5; H=7.1. В течение 3-х дней до операции и весь послеоперационный период животных содержали в индивидуальных клетках. Спустя 48 ч. после операции приводящую линию канюли присоединяли к шприцу объемом 1 мл, содержащему модифицированный раствор Рингера (NaCl 146 mM, KCl 4.0 mM, CaCl₂ 2.2 mM), нагнетание раствора осуществляли безынерционным насосом CMA/100 с объемной скоростью 2 мкл/мин. Отводящую линию канюли помещали в микропробирку, содержащую 5 мкл хлорной кислоты. Сбор диализата производили 25 мин., после чего пробирку с диализатом немедленно помещали в жидкий азот и заменяли следующей. После окончания сбора 4-й пробы, не прекращая диализной процедуры, животное помещали в стеклянную полусферу диаметром 30 см. В дальнейшем собирали еще 4 пробы диализной жидкости, после чего исследование завершали. Полученные пробы хранили при температуре -70˚С в течение 1 месяца. Биохимические исследования. Содержание ДА определяли методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с использованием электрохимического детектора. Образцы пробы вводили в объеме 40 мкл в хроматографическую систему без предварительной модификации. Хроматографическая система состояла из насоса 305 Gilson (США), инжектора Rheodyne, колонки Partisil 5ODS3 (4.6х250.0 мм), предколонки Pellicular ODS (4.6х70.0 мм) и амперометрического детектора LC-4B BAS. Определение концентраций исследуемых веществ проводили при потенциале +0.75 В. Подвижная фаза состояла из 0.02 М цитрат-фосфатного буфера (рН 3.5), 0.002 М Na₂ЭДТА, 0.004% октилсульфата натрия, 6.5% метанола при скорости потока 1.2 мл/мин. Время анализа составляло 40 мин. Статистический анализ проводили с использованием ANOVA.

Результаты исследования и их обсуждение. Прижизненное определение содержания ДА в структурах мозга является ценным показателем функционирования ДА-ергической системы. У животных, выращенных в условиях социальной изоляции от сородичей или в условиях группы, после помещения в новую обстановку (экспериментальную камеру, представлявшую стеклянную полусферу диаметром 30 см) уровни ДА в прилежащем ядре были повышены по сравнению с исходными величинами. При этом у крыс-изолянтов в течение первых 50 мин. пребывания в экспериментальной камере содержание медиатора были достоверно выше, чем у контрольных животных. Однако в последующие 25 мин. уровень ДА у изолянтов практически возвращался к исходным величинам, в то время как у животных контрольной группы еще достоверно отличался от начального. Таким образом, у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, реактивность ДА-ергической системы мозга выше, чем у сгруппированных животных. Вместе с тем, система ДА у крыс-изолянтов быстрее возвращается к исходному уровню, что указывает на ее бóльшую лабильность и, возможно, более быструю истощаемость.

Посмертное определение нейромедиаторов в структурах головного мозга предоставляет данные лишь об их суммарном содержании, которое определяется в основном темпом их синтеза и мало отражает физиологически значимые колебания. Для исследования связи активности медиаторных систем с теми или иными фазами поведения приходится использовать большое количество животных и опираться на косвенные признаки, такие, например, как уровень метаболитов. Метод микродиализа позволяет исследовать активность нейрохимических систем непосредственным измерением содержания внеклеточного пула медиатора. При этом имеется возможность оценки изменения активности той или иной системы с течением времени у одного и того же животного. Это повышает статистическую ценность получаемых данных.

Социальная изоляция крыс от сородичей меняет поведение животных, что проявляется повышением двигательной и исследовательской активности, реактивности на введение агонистов ДА, различных экспериментальных процедур, снижает порог болевых раздражителей, вызывает персеверации [4.5]. В наших исследованиях фенамин в диапазоне доз от 0.5 до 5 мг/кг существенно повышал реактивность ДА-ергической системы мозга крыс-изолянтов [1.2.4]. Вместе с тем, фенамин существенно увеличивает высвобождение внеклеточного пула ДА в прилежащем ядре и других ДА-ергических структурах мозга у свободно подвижных крыс при исследовании методом микродиализа [5]. Полученные нами данные об увеличении внеклеточного содержания ДА у крыс с различным индивидуальным опытом вполне укладываются в эту общую картину. При этом крысы-изолянты в отличие от сгруппированных особей более активно реагируют на новую для них обстановку. В работе [5], в которой в сходных условиях эксперимента изучали реакцию крыс-изолянтов на процедуру электрокожного наказания, найдено, что повышение высвобождения экстраклеточного ДА было более выражено и регистрировалось более длительно у изолянтов, нежели у сгруппированных животных. При этом уровни основных метаболитов ДА 3.4-диоксифенилуксусной и гомованилиновой кислот практически не менялись за исследуемый период времени или же менялись незначительно, не повторяя динамику изменений самого медиатора. В то же время, эти авторы [5] также нашли, что нормализация повышенного уровня ДА происходит приблизительно к 120-й мин. наблюдений. Аналогичные результаты получены и в нашей работе, когда нормализацию базального уровня внеклеточного ДА регистрировали в период между 125-й и 150-й мин. исследования.

Таким образом, полученные данные предполагают несколько общих заключений. Показатель внеклеточного содержания ДА является достаточно чувствительным для исследования ДА-ергической системы мозга. На основании изменений уровня внеклеточного ДА можно косвенно судить об активности ДА-ергической структуры мозга, в нашем случае об активности прилежащего ядра. У крыс-изолянтов ДА-ергическая система, по-видимому, более чувствительна к воздействию внешних факторов (более лабильна), в наших опытах это реакция на новую экспериментальную обстановку. Степень лабильности системы ДА у животных, выросших в условиях социальной изоляции от сородичей, ограничена. Нормализация базального уровня экстраклеточного содержания ДА наблюдается через 2-2.5 ч после сильного стрессогенного воздействия. В наших исследованиях таким агентом было помещение в новую экспериментальную обстановку, в исследованиях других авторов – значимое для животных электрокожное наказание. И, наконец, показатели уровней внеклеточного ДА могут в определенной степени служить критерием объективной оценки поведенческих феноменов, связанных с активностью ДА-ергической системы мозга. Это предполагает адекватное использование методики для изучения общих закономерностей формирования зависимости от психоактивных средств, избирательно влияющих на ДА-ергическую передачу мозга. Исследование поддержано Российским фондом фундаментальных исследования (грант №01-04-49073).