Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VII Междисциплинарная конференция по биологической психиатрии «Cтресс и поведение»

Взаимодействие пептидов и сон у кроликов

Согласно недавно предложенной оригинальной гипотезе [4], именно комплексное, а не одиночное применение пептидов и их аналогов является наиболее естественным и эффективным, поскольку в целом организме регуляция функций осуществляется на основе пептидного континуума [2]. Предварительный теоретический поиск с использованием векторного анализа выявил несколько таких комбинаций, способных оказывать выраженный психотропный (анксиолитический) эффект, в частности, комбинация нонапептида DSIP (дельта-сон индуцирующий пептид) с более длинным нейропептидом NPY (нейропептид-тирозин, 36 аминокислотных остатков) [4]. Поскольку антифобические эффекты обычно сочетаются со стресс-протективными и сомногенными, то с целью проверки вышеприведенной гипотезы мы впервые предприняли изучение действия на цикл сон-бодрствование подопытных животных парной комбинации пептидов: DSIP и NPY, введенных непосредственно в желудочки мозга.

Методика. Опыты проведены на взрослых кроликах-самцах шиншилла (животных со слабо выраженной циркадной ритмичностью) с хронически вживленными электродами для регистрации ЭЭГ новой коры, гиппокампа и обонятельной луковицы, а также электромиограммы шейных мышц (ЭМГ), и канюлей в боковом желудочке мозга (в/ж) для введения пептидов. Операции выполнены под местной анестезией (2% раствор новокаина). Для проверки локализации кончика канюли и сохранности тока ликвора по внутренним полостям мозга, накануне и по окончании каждого опыта был применен прижизненный функциональный тест - введение через канюлю 250 мкл 2% раствора мединала; возникновение у кролика в течение 5 мин нистагма свидетельствует о проникновении вводимого раствора в область сильвиего водопровода [3]. Круглосуточную непрерывную безбумажную полиграфическую регистрацию проводили одновременно у 4 кроликов, помещенных в индивидуальные камеры (электрически- и звукоизолированные, терморегулируемые, снабженный освещением регулиру­емой яркости и панорамным глазком), к которым они были заранее адаптирова­ны. С помощью гибких кабелей животных подключали ко вхо­ду 16-канального электроэнцефалографа "Медикор" (Венгрия), выполнявшего роль усилителя и монитора аналоговых сигналов. Для предотвращения закручивания кабелей применяли многоканальные поворотные токосъёмники (Litton Precision Products, U.S.A.) и систему вертикальной балансировки. Температура в камерах поддерживалась на уровне 21-23^оС. Свет (около 130 люкс) включался автоматически в 9 ч. и выключался в 21 ч.

У одних и тех же животных проводили 3 группы записей: (1) фон - регистрация сна-бодрствования без введений; (2) контроль – регистрация после введения растворителя (изотонический раствор NaCl) в объёме 60-80 мкл в боковой желудочек мозга через канюлю; (3) опыт - аналогичные введения тестируемого пептида (пептидов). Регистрация начиналась в 21 час, сразу после введения веществ, и продолжалась 24 ч. Перед началом каждого опыта, а также по окончании регистрации, проводили измерение ректальной температуры кроликов с помощью электротермометра. Во время регистрации сигналы с выхода электроэнцефалографа (по 4 сигнала от каждого кролика: ЭЭГ коры, гиппокампа и обонятельной луковицы, ЭМГ) подавались на вход­ную плату ЭВМ, где подвергались оцифровке, фильтрации и квантованию. ЭЭГ коры, кроме того, подвергалась спектральному анализу по 4-сек эпохам на частотах 1-25 Гц с помощью стандартной процедуры быстрого преобразования Фурье. Программное обеспечение позволяло проводить преобразование, анализ и накопление поступающей информации, а также производить визуальную идентификацию (стадирование) трех состояний - бодрствования, медленного и парадоксального сна. Для хранения экспериментального материала использовали жесткий диск, стример (HP JetStore) и CD-Writer. После завершения стадирования производили количественный подсчет суммарной доли (представленности) каждого из трех сос­тояний за каждый час записи в мин и процентах. Усредненные данные по трем группам (фон, контроль и опыт у одних и тех же животных) сравнивали между собой. Для статистического расчета использовали дисперсионный анализ и непараметрические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни из пакета Statistica for Windows, V.5. Пептиды NPY (фирмы ICN) и DSIP (синтезированный И.И.Михалевой и И.А.Прудченко, ИБХ РАН) хранили в сухом виде в холодильнике при –5^оС и растворяли ex tempori в изотоническом растворе NaCl.

Результаты и обсуждение. В серии опытов на четырех кроликах проведено по 1 в/ж введению NPY в дозе 0.7 нмоль (N=4/4), по 2 введения NPY в дозе 7 нмоль (N=8/4) и по одному совместному введению: NPY+DSIP (7+30 нмоль, соответственно, N=4/4). Результаты сравнивались с 8 контрольными и 8 фоновыми записями. В другой серии было изучено аналогичным образом действие на сон пептида DSIP в дозе 30 нмоль в/ж (N=8/4).

Предварительные результаты показывают, что в/ж введение NPY в малой дозе (0.7 нмоль) оказывало двуфазное воздействие на цикл сон-бодрствование кроликов: в первые 6 ч. происходило некоторое увеличение суммарной представленности медленного сна в записи (от 175 в контроле до 200 мин., т.е. +25 мин; P<0.05, U-test), сменявшееся значительным (от 181 до 128 мин., т.е. -53 мин) и достоверным (p<0.05) его снижением во вторую половину субъективного ночного периода (7-й – 12-й часы). В целом за весь 12-часовый период баланс был в сторону снижения представленности медленного сна по сравнению с контролем (на -28 мин; NS). Десятикратное увеличение вводимой дозы NPY (7 нмоль) приводило к тому, что тенденция к увеличение суммарной представленности медленного сна в первую половину ночи усиливалась (+29 мин; p<0.05), а к его снижению во вторую половину ночи – ослаблялась (-30 мин; p<0.05); таким образом за весь 12-часовый период изменений представленности медленного сна по сравнению с контролем не происходило (-2 мин; NS). Наконец, совместное введение двух пептидов - NPY (в большой дозе) и DSIP - вызывало достоверное (p<0.05) увеличение суммарной представленности медленного сна в первую половину ночи почти на треть (+57 мин), а тенденция к ее снижению во вторую половину ночи – сглаживалась (-4 мин; NS), так что в целом баланс был явно в сторону увеличения сна (+53.5 мин). Изучение эффектов пептида DSIP выявило лишь недостоверную тенденцию к увеличению суммарной представленности медленного сна в 1-ю (+14 мин; NS), 2-ю (+8 мин; NS) половину и за весь 12-час. период записи (+21 мин; NS). Изменений представленности парадоксального сна под воздействием данных пептидов при их раздельном и совместном введении не наблюдалось. В последующей 12-часовой дневной записи заметных изменений структуры сна выявлено не было. Температура тела существенных нарушений не претерпевала. Таким образом, исходная гипотеза было подтверждена: действительно, совместное введение двух нейропептидов – NPY и DSIP – оказывало значительно больший эффект на последующий сон кроликов, чем их раздельные инъекции. При этом если седативные и анксиолитические свойства NPY хорошо известны, то его сомногенная активность остается практически не изученной [5]. Настоящее исследование впервые выявило двуфазную кривую этой активности, которая смещается вверх по оси ординат при увеличении дозы.

Что касается пептида DSIP, то наши исследования, проведенные в трех тест-системах: на кроликах при в/ж инъекциях и на крысах при в/ж инъекциях и инфузиях, не выявили сомногенной активности у этого пептида [2]. Была выяснена и причина его неактивности в ряде тестов in vivo; это – быстрая деградация под воздействием в первую очередь аминопептидаз мозга, поскольку у нескольких аналогов DSIP с заменами остатков в первом и втором положении, значительно повышающими протеолитическую устойчивость пептидов, сомногенная активность действительно была обнаружена [3]. Однако в данном случае DSIP, продемонстрировавший, как и в наших прежних опытах, отсутствие такой активности (отмечалась лишь небольшая и недостоверная тенденция к увеличению медленного сна), неожиданно обнаружил способность взаимодействовать с NPY, потенциируя его эффекты на сон.

Известно, что гормоны стресса – кортиколиберин, кортикотропин и кортикостероиды – вызывают поведенческую активацию и подавление сна. Учитывая, что и NPY, и DSIP подавляют ось стресса [2.5], можно высказать предположение, что их действие на сон при совместном введении является неспецифическим и отражает возникающий гормональный дисбаланс. Вполне обоснованным в таком случае будет предположение, что другие виды воздействия этих пептидов на поведение (стресс-протективное, анксиолитическое) также являются следствием эндокринных воздействий и будут усиливаться при совместном введении. Проверка этой гипотезы должна явиться целью дальнейших исследований. Исследования поддержаны грантами РФФИ: №№01-04-49496, 02-04-48318.