Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VII Междисциплинарная конференция по биологической психиатрии «Cтресс и поведение»

Центральные эффекты crf4-6 воспроизводят действие целой молекулы кортиколиберина

Стресс – системная реакция организма, играющая важную роль в адаптации животных к условиям окружающей среды. Высвобождение из гипоталамуса кортиколиберина (CRF) является одним из начальных этапов стресс-реакции. CRF занимает центральное место в регуляции и интеграции эндокринных, вегетативных и поведенческих компонентов ответа организма на стрессирующее воздействие [3]. Трипептид CRF_4-6 (Pro-Pro-Ile) соответствует консервативному фрагменту аминокислотной последовательности пептидов семейства кортиколиберина. Известно, что CRF_4-6, не влияя на активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [4], имеет ряд общих с кортиколиберином центральных эффектов. Так, оба пептида оказывают общевозбуждающее и анксиогенное действие [1.2], а в больших дозах вызывают судороги у крыс и мышей [1-4]. Основываясь на этом, а также на данных о влиянии кортиколиберина на сердечно-сосудистую систему и ноцицепцию, мы исследовали влияние CRF_4-6 на частоту сердечных сокращений (ЧСС) и поведение, тревожность и болевую чувствительность крыс.

Методика. Эксперименты выполнены на самцах беспородных белых крыс весом 350-450 г. В работе использовали трипептид Pro-Pro-Ile (CRF_4-6), синтезированный в Институте молекулярной генетики РАН. CRF_4-6 вводили в боковой желудочек головного мозга крыс в дозах 6, 30 или 150 нмоль/крысу, в контроле использовали физиологический раствор. Объем вводимой жидкости составлял 5 мкл. Вживление канюли: операцию проводили под нембуталовым наркозом (45 мг/кг, внутрибрюшинно). Канюли длиной 7 мм изготавливали из инъекционных игл Ø 0.8 мм. Координаты вживления канюли: AP 0; L 2-2.5; H 4-4.5. Для закрепления на черепе использовали фиксирующий винт (1.5х5мм), который вкручивали в теменную кость на некотором отдалении от канюли, и самотвердеющую пластмассу. Вживление электродов для регистрации электрокардиограммы: в первой серии экспериментов одновременно со вживлением канюли проводили имплантацию электродов. Подкожные электроды для регистрации ЭКГ представляли собой трехконтактный разъём с припаянными проводками длиной 4-5 см, к концам которых в свою очередь припаяны колечки Ø 4 мм из серебряной проволоки Ø 0.5 мм. Разъем служил для подключения электродов к усилителю. Концы электродов располагали следующим образом: "земля" - в левой надплечевой области, регистрирующие - в левой и правой подмышечных областях. Колечки подшивали к коже, чтобы избежать смещений при движении животного. В послеоперационный период (2-3 дня) и во время опытов крысы находились в индивидуальных плексигласовых камерах 30х30х30 см с постоянным доступом к воде и пище. ЧСС и поведение: в первой серии экспериментов электроды для ЭКГ с помощью гибкого провода длиной 70 см подключали к усилителю, сигнал от которого подавался через аналогово-цифровой преобразователь на компьютер. Для введения растворов использовали микрошприц объемом 10 мкл, к которому подсоединена гибкая трубочка длиной 60 см с наконечником из инъекционной иглы Ø 0.5 мм, который вставляли в канюлю до начала эксперимента. Такая конструкция позволяла вводить вещества в желудочки мозга непосредственно в ходе эксперимента, не прерывая его и не беспокоя животное. Затем животное адаптировали к экспериментальным условиям не менее 30 мин.

Одновременную регистрацию ЭКГ и поведения, а также обработку данных осуществляли с помощью оригинальной компьютерной программы (А.С.Боровик, Институт хирургии им. А.В.Вишневского, Москва). В эксперименте выделяли 3 периода: фон (13 мин), введение веществ (2 мин) и после введения (45 мин). Регистрацию ЭКГ и поведения осуществляли непрерывно в течение часа. Поведение оценивали визуально, выделяя движение, пассивное поведение, ориентировочно-исследовательскую активность, груминг, еду, питье, сон. Тревожность. Во второй серии экспериментов использовали методику крестообразного приподнятого лабиринта. Лабиринт представляет собой крестообразную платформу, приподнятую над полом на центральной опоре на высоту 80 см, с четырьмя лучами (ширина - 10 см, длина - 45 см). Пара несоседних лучей имела боковые стенки высотой 10 см, другие лучи - полностью открыты. Использовали 3 группы животных: 2 опытные – с введением раствора CRF4-6 (30, 150 нмоль/крысу) и контрольную. CRF_4-6 вводили за 1 мин до опыта. Крысу помещали на центральную часть платформы головой в сторону открытого луча. В течение 5 мин регистрировали следующие показатели: первый выбор; латентный период первого выбора; заходы в закрытые и открытые лучи; заглядывания в открытые лучи; общую продолжительность нахождения на открытых лучах; продолжительность замирания; количество и общую продолжительность актов груминга; стойки; дефекации.

Болевая чувствительность. В третьей серии экспериментов использовали метод "hote plate" (прибор фирмы "Socrel" с температурой платформы +53˚С). Регистрировали латентный период облизывания лапы. Проводили шесть измерений с интервалом 15 мин - три фоновых, три - после введения веществ и еще одно - через 30 мин. Морфоконтроль: всем животным после эксперимента под наркозом (нембутал, 45 мг/кг, внутрибрюшинно) вводили в канюлю 5 мкл диализованной туши и перфузировали через левый желудочек сердца вначале физиологическим раствором, а затем - раствором формалина, после чего крысу декапитировали и голову помещали в 10% раствор формалина на несколько дней. Вживление канюли считали успешным, если тушь обнаруживалась на фронтальных срезах мозга хотя бы в одном из боковых желудочков. В иных случаях данные исключали из обработки. Статистическую обработку результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни.

Результаты. Влияние CRF_4-6 на ЧСС и поведение. Трипептид дозозависимо повышал частототу сердечных сокращений у крыс. Максимальная величина ЧСС составила: 393.8±8.9, 419.5±14.9 и 449.8±15.7 уд/мин (CRF_4-6: 6, 30 и 150 нмоль/крысу). Длительность эффекта для этих доз составила 4, 5 и 33 мин. В контроле ЧСС у крыс была равна 358.3±5.8 уд/мин и оставалась практически неизменной. Трипептид вызывал активацию поведения животных. Так, в течение 15 мин после введения трипептида увеличивалась доля активного поведения (движение, еда, питье, груминг): 16, 44 и 53% времени (CRF_4-6: 6, 30 и 150 нмоль/крысу), в то время, как продолжительность пассивного поведения и сна снижалась. После введения физиологического раствора у крыс преобладали пассивное поведение и сон (62 и 24% времени). Таким образом, CRF_4-6 повышает ЧСС и активирует поведение крыс в привычных условиях. Стимуляция работы сердца, вызываемая трипептидом, по нашему мнению, связана не только с увеличением двигательной активности животных. CRF_4-6 дозозависимо повышает частоту сердцебиений при всех видах поведенческой активности животного. Так, например, ЧСС при пассивном поведении увеличивается с 351.1±1.9 до 359.9±6.2, 360.2±7.1 и 394.4±7.0 уд/мин (CRF_4-6: 6, 30, 150 нмоль/крысу). Это свидетельствует о наличии у трипептида собственного кардиотропного эффекта, проявляющегося при всех видах поведения крыс.

Влияние CRF_4-6 на тревожность. CRF_4-6 оказывал анксиогенное действие в крестообразном приподнятом лабиринте. Трипептид дозозависимо подавлял двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность: количество стоек снижалось на 58 и 96%, заглядываний в открытые лучи – на 38 и 60% (30 и 150 нмоль/крысу). Кроме того, продолжительность груминга снижалась на 61 и 79%, а продолжительность пассивного поведения увеличивалась на 98 и 126% для указанных доз.

Влияние CRF_4-6 на болевую чувствительность. CRF_4-6 дозозависимо повышал порог болевой чувствительности. Так, латентный период облизывания лап после введения трипептида увеличивался на 7.4, 10.1 и 16.7 сек (CRF_4-6: 6, 30 и 150 нмоль/крысу). Длительность антиноцицептивного действия трипептида превышала 30 мин, а в случае с большей дозой продолжалась более часа. Таким образом, CRF_4-6 вызывает увеличение частоты сердечных сокращений, активацию поведения в привычных условиях, увеличение тревожности в стрессирующей обстановке и снижение болевой чувствительности. Аналогичным действием при центральном введении обладает и кортиколиберин. Подобный спектр эффектов соответствует картине стресс-реакций организма, в реализации которых CRF принадлежит одна из основных ролей [3].

Сходство эффектов CRF и его фрагмента CRF_4-6 может свидетельствовать о том, что трипептид является частью активного центра молекулы гормона или его физиологически активным эндогенным дериватом. В пользу этого предположения говорит и близкий диапазон эффективных доз фрагмента CRF_4-6, использованного в нашей работе, и CRF, который, по данным разных авторов, варьирует в диапазоне 0.02-2.1 нмоль/крысу. Важными представляются также сведения о нейрональном, а не гормональном механизме влияния кортиколиберина на работу сердечно-сосудистой системы и поведение животных [3]. Это хорошо согласуется с эффектами CRF_4-6, который не оказывает гормонального действия [4] и вызывает быстрые эффекты при центральном введении. Можно предположить, что эффекты трипептида опосредуются нейрональными рецепторами кортиколиберина, отличными от гипофизарных, или своими собственными рецепторами. Дальнейшие исследования позволят получить новые данные о физиологическом действии трипептида CRF_4-6. Дополнительные факты можно получить в экспериментах с использованием антагонистов рецепторов кортиколиберина.

Выводы. CRF_4-6 (6, 30, 150 нмоль/крысу) при введении в боковой желудочек мозга повышает частоту сердечных сокращений у бодрствующих крыс (длительность кардиотропного эффекта составляет 4, 5 и 33 мин соответственно), активирует поведение крыс в привычных условиях (повышается двигательная и ориентировочно-исследовательская активность, сокращается продолжительность пассивного поведения и сна), оказывает анксиогенное действие в крестообразном приподнятом лабиринте, снижает болевую чувствительность животных в тесте "hote plate" (латентный период облизывания лап увеличивается на 7.4, 10.1 и 16.7 сек соответственно).