Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VII Междисциплинарная конференция по биологической психиатрии «Cтресс и поведение»

Использование tail-flick методики для оценки центральных эффектов цнс

Несмотря на то, что на протяжении последних 30-ти лет наблюдалось непрерывное совершенствование и развитие новых тестов для оценки действия различных фармакологических агентов, наиболее отработанным и часто применяемым сегодня является tail-flick (ТФ) тестирование. С целью исключения влияния феномена привыкания при многократном ТФ тестировании, общепринято оценку действия препарата проводить за счет малого числа проб на большом количестве животных. Латентный период реакции отдергивания хвоста принято интерпретировать лишь как свойство чувствительности болевых рецепторов кожи хвоста. При таком подходе исследователь неизбежно сталкивается с другой проблемой - большой вариабельностью индивидуальной чувствительности животного к болевому воздействию в ситуации новизны, размах которой может перекрывать эффект действия препарата. Однако, как тепловое болевое воздействие ТФ тестирования, так и воздействия, привносимые процедурой введения фармакологических веществ (в том числе и укола), по своей природе имеют более сложный ответ как со стороны периферической, так и центральной нервной системы (ЦНС). Как известно, болевая чувствительность периферии находится под контролем ЦНС, а привыкание к условиям ТФ тестирования может служить одной из наиболее простых моделей отражения центральных (психических) феноменов ЦНС, таких как ожидание, память, обусловленных вовлечением животного в процесс научения. В настоящей работе предпринята попытка уловить не только периферические, но и центральные эффекты действия малых доз гепарина и опилонга с помощью ТФ методики в ситуации примитивного научения – привыкания к слабому болевому воздействию.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Эксперименты проведены на самцах крыс линии Вистар массой 200-230 г (n=60), которых содержали в условиях лабораторного вивария в отдельных клетках группами по 10 особей. Для оценки эффектов препаратов модифицировали стандартную методику tail-flick. До начала введения препаратов осуществляли процедуру привыкания к болевому воздействию, заключавшуюся в том, что с периодичностью 20 с у каждого животного проводили по 10 измерений утром, в 10 ч, и вечером, в 16 ч. При устойчивости ответа в течение трех дней начинали введение исследуемых веществ: серия 1 (n=20) - ТФ тестирование 0.5 мл физраствора; серия 2 (n=20) – нефракционированного гепарина фирмы Serva (Германия) в дозе 0.36 мг/кг (64 МЕ/кг), предварительно растворенного в 0.85% физрастворе; серия 3 – опилонга, синтетического аналога дерморфина в дозе 0.05 мг/кг. Все вещества вводили внутрибрюшинно 1 раз в день, в течение 5 дней. ТФ тестирование проводили в 10 ч утра - до инъекции веществ, а затем через 30 мин, 5 ч и 24 ч после введения, выполняя по 10 измерений в тесте у каждого животного. После отмены препаратов тестирование болевой чувствительности осуществляли в течение последующих 5 дней. Измерения латентного периода (ЛП) реакции отдергивания хвоста проводили с помощью анальгезиметра "Analgesia-test" фирмы "Hugo Sachs Elektronik" (Германия) на фоне пищевой депривации, составляющей 23 ч. Доступ к воде был не ограничен.

Результаты. Процедура привыкания к ТФ тестированию, в целом, занимала три дня, как в утренних, так и вечерних пробах, в течение которых было предъявлено по 30 проб. В последующие три дня ЛП устойчиво сохранялся на уровне 3.59±0.02 с (M±m) в утренних и вечерних пробах, коэффициент вариации не превышал 1.35±0.7%. Пятикратное введение физраствора вызвало значимые и устойчивые изменения в характере ТФ ответа. Первое введение сразу же привело к резкому снижению средних значений ЛП (3.17±0.03; p<0.05), которое сохранялось непродолжительно, так как в вечерних пробах (через 7 ч после инъекции) средние значения ЛП возвращались к исходному уровню. Однако уже при повторной инъекции стала формироваться закономерность, навязчиво проявляющаяся при последующих воздействиях: в утренней пробе, непосредственно предшествующей введению физраствора (через 24 ч после предыдущей инъекции) ЛП реакции животного были уже достоверно снижены (до 3.24±0.04 с), которые после инъекции (через 30 мин) еще более снижались, возвращаясь к исходному уровню в течение последующих 7 ч. После отмены инъекций обнаруженные изменения значений средних ЛП сохранялись на протяжении трех дней. Причем, как показал статистический анализ, отклонения в характере распределения ЛП (нормы реакции, показателей асимметрии и эксцесса), вызванные введением физраствора, сохранялись после отмены воздействия в течение 4 дней тестирования (80 измерений).

Введение небольших доз опилонга привело к более резкому снижению средних значений ЛП, до 3.12±0.02 с (M±m), которые, в отличие от физраствора, достигали своего минимума (2.95±0.03) только через 7 ч, устойчиво сохраняясь на этом уровне в течение 24 ч и после второго введения. В дальнейшем, начиная с 3-ей инъекции, обнаружился эффект накопления: чем больше было сделано инъекций, тем ниже становились значения ЛП, достигая после 5-ой инъекции ЛП=2.83±0.02. В отличие от физраствора, изменения, вызванные введением малых доз опилонга, сохранялись после отмены воздействия дольше, в течение 5-ти дней тестирования. Кроме того, изменения параметров – асимметрии и, в особенности, эксцессивности, отражающих характер распределения значений резко колебались и меняли свой знак на протяжении всех тестирований.

В отличие от двух предыдущих веществ, внутрибрюшинное введение малых доз высокомолекулярного гепарина, сопровождалось многофазными изменениями реакции отдергивания хвоста. Первое введение спровоцировало во многом сходные с опилонгом изменения ЛП ответа. Однако в отличие от последнего, значимое снижение ЛП ответа наблюдалось не сразу после введения, а через 7 ч после инъекции, достигая минимума значений только через 24 ч (2.92±0.04 с). На второе введение крысы реагировали резким увеличением средних значений ЛП (до 4.15±0.05 с), после чего ЛП закономерно начали снижаться и, как в случае с физраствором, через 24 ч в утренней пробе, непосредственно предшествующей процедуре инъекции, значения ЛП отдергивания хвоста вновь оказывались достоверно сниженными по сравнению с исходным уровнем (3.26±0.05 с). Начиная со второго введения устойчиво проявлялась следующая закономерность: перед каждой очередной инъекцией значения ЛП были достоверно снижены, а сразу после укола (через 30 мин) они резко повышались с постепенным в течение 24 ч снижением этих значений до уровня 3.11±0.012 с. После отмены препарата значения средних возвращались к норме только к 5-му дню, в то время как неустойчивость ответа по параметрам распределения продолжала сохраняться в течение последующих 5-ти сут.

Обсуждение. В результате проведенной работы получен ряд фактов, заслуживающих внимания. С помощью условнорефлекторной процедуры привыкания к болевому воздействию удалось обнаружить, что сама процедура введения физраствора (традиционно принятый контроль в фармакологии) сопровождается формированием у животного закономерности в виде регулярного повышения болевой чувствительности перед очередной инъекцией. Двух уколов оказалось достаточно, чтобы эти изменения оказались устойчивыми и долго сохранялись после отмены инъекций. Динамика этих изменений указывает на центральное, условнорефлекторное происхождение этой реакции в виде психического феномена ожидания болевого воздействия, связанного с уколом, а не с процедурой ТФ тестирования. Сопоставление с результатами наших поведенческих исследований показывает, что пятикратное болевое воздействие, связанное с введением физраствора способствовало формированию оборонительной доминанты, поскольку 90% крыс вместо 40% в группе интактных животных отказывались от обучения и демонстрировали признаки невротизации в течение 30 дней исследования. Из этого следует, что безобидная на первый взгляд процедура введения физраствора, далека от привычного понятия «контроль».

Другой позитивный эффект процедуры привыкания при использовании методики ТФ, по нашему мнению, состоит в том, что благодаря многократному тестированию животного достигается высокая устойчивость реакции (коэффициент вариации ответа не выходит за рамки погрешности измерения - до 3%), за счет чего она оказывается высоко чувствительной к любым, в том числе фармакологическим воздействиям. Периферические эффекты синтетического аналога дерморфина – опилонга заключались в резком снижении ЛП, что можно было бы интерпретировать как повышение болевой чувствительности животного. Однако отсутствие феномена ожидания болевого воздействия, несмотря на процедуру укола, облегчение процесса обучения у опилонг-индуцированных крыс и редукция оборонительных проявлений у них свидетельствуют об анксиолитическом действии препарата. Поэтому пролонгированное снижение ЛП ответа в процедуре ТФ, скорее всего, есть следствие общей активации ЦНС, так как введение опилонга вызывало повышение чувствительности к любым внешним воздействиям, в том числе и к тактильным. В отличие от опилонга интерпретация периферических эффектов гепарина вызвала серьезные затруднения, поскольку многократные инъекции, с одной стороны, сопровождались формированием феномена ожидания болевого воздействия, а с другой стороны, сразу же после введения препарата проявлялось непродолжительное, но четко выраженное, его анальгетическое действие. Последний факт хорошо известен в клинической практике, однако мы не нашли литературных работ, посвященных изучению этого вопроса. Поведенческие исследования показали, что гепарин в малых дозах оказывал сильное психостимулирующее действие, которое устойчиво обнаруживалось на протяжении 2 месяцев после отмены препарата. Он снимал депрессивно-подобные проявления у животных с исходно подавленными признаками познавательной деятельности, увеличивал скорость обучения и проявлял анксиолитическое действие. Это скорее указывает на то, что при введении гепарина, феномен ожидания в виде снижения ЛП, отражает повышение общей чувствительности за счет активации ЦНС, как и в случае введения опилонга. Таким образом, использование условнорефлекторной процедуры привыкания к слабому болевому воздействию (методика tail-flick тестирования) при введении веществ различной природы, позволяет фиксировать изменения, которые отражают не только особенности периферического ответа, но и влияние центральных механизмов.