Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VΙΙ Российская онкологическая конференция

Соматические мутации гена к-ras в аденокарциномах толстой кишки и поджелудочной железы и их диагностическое и прогностическое значение

Развитие аденокарцином поджелудочной железы и толстой кишки протекает с минимальными клиническими симптомами, поэтому только в небольшом числе случаев эти опухоли диагностируются на ранних стадиях. В этой связи поиск новых методов ранней диагностики сосредоточен на молекулярной этиологии этих заболеваний. К настоящему времени уточнена диагностическая значимость определения мутаций в генах семейства ras (Н-ras, К-ras, N-ras) [7]. Возможность использования соматических мутаций в К-ras онкогене в диагностических целях обусловлена их высокой частотой в опухолях разных локализаций, небольшими размерами гена, при которых, как правило, мутация локализована в специфическом кодоне. При этом K-ras мутации регистрируются при раке поджелудочной железы, толстой кишки, в полипах, мелких аденомах толстой кишки, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных маркеров для ранней диагностики этих неоплазий.

 

В настоящей работе проведен молекулярный анализ мутаций в гене K-ras (кодон12 и 13) в образцах опухолевых тканей больных со спорадическими аденокарциномами с целью оценить их диагностическую и прогностическую значимость при раках толстой кишки и поджелудочной железы.

 

Материалом для исследования послужили образцы опухолевых тканей, полученные от 64 российских пациентов: 50 образцов аденокарцином и 1 беркиттоподобной лимфомы, 8 аденокарцином поджелудочной железы и 1 карциноид и 4 образца рака легкого (2 аденокарциномы, 2 плоскоклеточных рака). У каждого из этих больных было проведено хирургическое удаление опухоли, паллиативное или в полном объеме.

 

Отбор образцов опухолей из операционного материала проводили методом микродиссекции под гистологическим контролем, поэтому полученные препараты содержали не менее 70% опухолевых клеток. В качестве контроля использовали 55 образцов с гистологически верифицированными нормальными тканями от больных раком толстой кишки и легкого, а также 9 образцов из лимфоцитов периферической крови больных раком поджелудочной железы. Геномную ДНК из опухолевых и нормальных тканей, а также из лимфоцитов периферической крови выделяли с помощью набора QIAamp Blood and Tissue Kit фирмы QIAGEN в соответствии с протоколом. При амплификации K-ras–фрагментов (157 п.о. и 200 п.о.), содержащих 12 и 13 кодоны, использовали следующие праймеры: 1. 5/ ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 3/ и 5/ TCAAAGAATGGTCCTGGACC 3/ - для фрагмента размером 157 п.о., 2. 5/ GTACTGGTGGAGTATTTGATA 3/ и 5/ ACTCA TGAAAATGGTCAGAGA 3/ - для фрагмента размером 200 п.о. Реакционная смесь объемом 35 мкл содержала 0,3-0,4 мкг геномной ДНК, 25 пикамоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 10 мМ трис/HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCL2 и 1,5 ед. Taq-полимеразы (“Perkin Elmer”). Режим ПЦР: денатурация ДНК при 95OC в течение 3 минут, затем: 94OC – 1 мин., 55OC –1 мин., 72OC –30 сек., всего – 30 циклов, с заключительным синтезом при 72OC в течение 7 мин. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР (фрагмент 157 п.о.) проводили с помощью эндонуклеазы Bst NI в условиях, рекомендованных изготовителем (“New England BioLabs”). Продукты рестрикции выявляли методом электрофореза в ПАА гелях после окрашивания их бромистым этидием. SSCP-анализ амплифицированного экзона 1 гена K-ras (157 п.о. и 200 п.о.) - безизотопным методом [1]. Секвенс амплифицированных генов K-ras (200 п.о.), содержащих аномалии, проводили с помощью автоматического секвенатора фирмы “Applied BioSystems”, модель 377, используя систему «BigDye-terminators». Статистический анализ полученных данных проводился общепринятыми методами статистики.

 

 

При наличии мутации, вследствие исчезновения одного из сайтов рестрикции образуются фрагменты 143 п.о. и 14 п.о. Для 7 опухолевых образцов результаты рестрикционного анализа были подтверждены секвенированием. У пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы частота точечной мутации GGT→GCT в к.12 составляет 33,3% (табл. 2). Еще 5 типов известных K-ras мутаций в опухолевых образцах были выявлены в ходе SSCP-анализа и детектированы с помощью автоматического секвенирования. При этом были секвенировано 9 образцов с мутациями, отличными от замены GT→CT в к.12, и 4 контрольных образца (без аномалий в гене K-ras). Результаты SSCP-анализа приведены на рис. 1. В итоге мутации в гене K-ras обнаружены у больных с аденокарциномами толстой кишки в 31,4% в к.12 и 5,9% в к.13. В группе аденокарцином и плоскоклеточного рака легкого мутации в гене K-ras не обнаружены, возможно, из-за незначительного количества обследованных больных. Мутации не были выявлены и в беркиттоподобной лимфоме толстой кишки и карциноиде поджелудочной железы. Ни в одном из исследованных образцов с нормальными тканями толстой кишки и поджелудочной железы, а также в лимфоцитах периферической крови мутации в гене K-ras обнаружены не были.

 

Рак поджелудочной железы, как и рак толстой кишки, относятся к опухолям поздней манифестации. В изученной нами выборке больных возраст варьировал от 29 до 85 лет и в среднем составил 60,7±9,2 года для больных с опухолями толстой кишки и 64±7,8 года - для больных с опухолями поджелудочной железы, что совпадает со средним возрастом пациентов с этими заболеваниями из Америки (62,5–65,4 года) [13]. Количество женщин в исследованной группе больных было ненамного больше, чем мужчин: 28 из 51 (51,5%) с опухолями толстой кишки и 5 из 9 (55,6%) с опухолями поджелудочной железы (табл. 1). Частота мутаций в гене К-ras у российских женщин оказалась в 2,6 раза больше, чем у мужчин (28,1% и 10,9% соответственно). Определение частоты мутаций K-ras в зависимости от стадии заболевания не проводилось, поскольку большинство опухолей рассматриваемых локализаций были получены от пациентов с III и IV стадиями заболевания (39/51 и 6/9 соответственно).

 

Как видно из таблицы, анализируемая группа больных находилась на разных, в основном поздних стадиях заболевания. Возраст пациентов, у которых были выявлены мутации, в среднем составил 64 года. Надо сказать, что из 9 больных раком поджелудочной железы только у 4 имелись указания на поражение злокачественными опухолями родственников 1-ой степени родства, и 2 случая из них были семейными раками той же локализации. По данным литературы, семейный рак поджелудочной железы составляет небольшую часть от всех неоплазий этой локализации, и в основе их развития могут быть наследственные факторы [10]. Наиболее существенными факторами, которые могли бы способствовать формированию групп риска, являются семейный хронический панкреатит и длительно существующий сахарный диабет. Однако у наших пациентов с выявленными мутациями только в одном случае больная длительное время страдала сахарным диабетом.

 

Таким образом, сопоставление клинико-генеалогических и выявленных молекулярных изменений при раке поджелудочной железы позволило нам отметить независимость мутаций в онкогене К-ras от степени дифференцировки опухоли, ее прогрессии и наследственной предрасположенности в случае семейного рака этой локализации. Полученные результаты позволяют обсуждать возможность существования одного из патологических путей в развитии рака поджелудочной железы, при котором мутации в гене K-ras могут занимать существенное место.

 

Рак толстой кишки представлен в изучаемой выборке 51 больным: 50 больных с аденокарциномой и 1 больной с лимфомой Беркитта. Возраст манифестации рака толстой кишки в среднем составил 61,6 года, что несколько меньше, чем возраст больных раком поджелудочной железы. Кроме того, возраст развития опухоли у женщин был несколько больше, чем у мужчин (62,9 и 59,9 года соответственно). В табл. 4 приведена частота K-ras мутаций в различных возрастных группах больных раком толстой кишки. Отметим, что частота замен в гене K-ras в подгруппе 50-55 лет в 2,8 раза превышает частоту в подгруппе 56-70 лет (p<0,05).

 

Изучение генеалогических данных у 51 больного раком толстой кишки показало семейное накопление различных злокачественных новообразований у 20 из них, причем в 3 случаях идентифицирован синдром раковых семей (синдром Линча II). В семейном анамнезе больных, у которых были выявлены мутации в гене K-ras (7/19), также имелись указания на накопления опухолей толстой кишки, которые встречались отдельно и в сочетании с другими злокачественными новообразованиями, однако ни в одной из указанных родословных признаков, указывающих на наследственный вариант рака толстой кишки, не обнаружено. Эти данные позволяют предположить, что мутации гена K-ras не играют важной роли в возникновении семейного рака толстой кишки.

 

Изучение частоты точечных мутаций в гене K-ras у больных со спорадическими аденокарциномами толстой кишки с различной степенью дифференцировки на разных стадиях заболевания показало, что она составляет 37,3%, что совпадает с данными, полученными некоторыми авторами в Швейцарии (39,2%), Нидерландах (39,0%), Италии (40,0%) [16, 19, 20], но в Германии и Ирландии частота данных мутаций значительно выше (73,3% и 76,0% соответственно) [4,9]. Доминирующей мутацией в нашей выборке оказалась замена GT→CT в к.12, которая также преобладает у японских больных с аденокарциномами толстой кишки (44,7%) [8]. Суммарная частота мутаций в к.13 гена К-ras у больных раком толстой кишки в нашей выборке составляет 5,9% Это примерно в 2 раза меньше частоты аналогичных мутаций у пациентов из Швейцарии (9,8%) и Кореи (11,0%) [5, 15].

 

Согласно данным литературы, мутации в гене K-ras присутствуют почти во всех аденокарциномах поджелудочной железы и в 50 % опухолей толстой кишки человека. Наличие мутаций у пациентов с аденокарциномами поджелудочной железы и отсутствие таковых в опухолях эндокринного происхождения той же локализации, а также при хронических панкреатитах и в нормальных тканях поджелудочной железы позволяет рассматривать возможность использования мутаций онкогена K-ras в качестве молекулярных маркеров для формирования групп высокого риска, для прогноза и контроля лечения [6, 12]. Решение всех этих задач существенно облегчается возможностью поиска K-ras мутаций в материале, собранном при эндоскопии: в секрете поджелудочной железы, в слизистой протоков поджелудочной железы после браш-теста или при холангиопанкреатографии, в дуоденальном соке и даже в стуле пациента. Обнаружение мутаций в гене K-ras в перечисленном выше биологическом материале может указывать на рак поджелудочной железы, тогда как их отсутствие увеличивает вероятность доброкачественной опухоли [18].

 

Что касается опухолей толстой кишки человека, то результаты многочисленных исследований, оценивающих прогностическое значение K-ras мутаций, весьма противоречивы. В некоторых работах не удалось показать корреляцию между K-ras мутациями и малигнизацией в толстой кишке [11]. Однако, в других исследованиях, включая работу с самой многочисленной на сегодняшний день выборкой (1413 пациентов), авторы пришли к выводу, что присутствие K-ras мутаций в опухолях толстой кишки все же является определенным фактором прогноза [17]. Несовпадение этих результатов, по нашему мнению, отчасти можно объяснить, во-первых, небольшими выборками пациентов в большинстве работ и, во-вторых, использованием различных методов детекции K-ras мутаций, обладающих разной разрешающей способностью (гибридизация, рестрикционный анализ, SSCP–анализ, DGGE–анализ). Тем не менее, эти исследования являются перспективными, т.к. позволяют проводить довольно быстрый скрининг диспластических поражений всех участков толстой кишки с целью формирования групп риска. Обнаружение K-ras мутаций в опухолях толстой кишки позволяет использовать их в качестве молекулярных маркеров для прогноза, а также контроля послеоперационного лечения. Как и в случае с поджелудочной железой, эта задача облегчается возможностью выявления K-ras мутаций в биологическом материале: копрологических и биопсийных препаратах, в кишечном секрете, в образцах плазмы крови. Для улучшения надежности молекулярного прогноза опухолей толстой кишки возможно использование нескольких генетических маркеров, определяющих одни и те же или различные этапы малигнизации.