30 декабря 2017

Патогенетические аспекты ВИЧ/СПИДа

Инфекционные и паразитарные болезни

Проникновение вируса в клетку является многоэтапным процессом, который начинается со связывания вируса с CD4 рецептором и хемокиновыми рецепторами на Т-хелперах. Рецептор для вируса представляет собой CD4 молекулу, расположенную на поверхностной мембране Т-хелперов, являющуюся мономерным белком и состоящую из 4 иммуноглобулиновых доменов, с молекулярным весом 55 кД. После связывания с рецептором гликопротеины вирусной оболочки сливаются с мембраной клетки-мишени, что позволяет вхождение сердцевины вируса в цитоплазму. gp 120 гликопротеин связывается с рецепторами на клетке хозяина, тогда как gp41 является ответственным за слияние вируса с клеткой после максимального приближении вируса к клетке. Связывание с рецептором не только прикрепляет и ориентирует поверхностные гликопротеины вируса к мембране клетки, но и изменяет конформацию гликопротеинов, которые проделывают последовательные этапы, ведущие к слиянию мембран. Природа этих изменений до сих пор не понята, так, наиболее изученным и к настоящему времени являются конформационные изменения gp 120. Связывание gp 120 с рецептором приводит к индукции его конформационных изменений, которые делают возможным связывание gp 120 с CCR5 хемокиновым рецептором, который необходим для эффективного вхождения в клетку практически всех изолятов вируса.

ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проявляют тропность к CD4 Т-лимфоцитам посредством связывания гликопротеина вирусной оболочки gp 120 с CD4 молекулой. До сих пор топография gp 120-CD4 связывающего региона остается не выясненной до конца. Lasky et al. показали, что аминокислотная последовательность 420-463 С-концевой части белка gp 120 вовлекается в CD4 связывание. Kleber-Emons et al. выявили, что пептиды, входящие в 428-445 область, обладают способностью блокировать образование синтиция. Замена аминокислот в позициях 427 и 434 прерывают связывание вируса или частично нарушает способность инфицировать клетку-мишень. Однако было показано, что N-концевая часть молекулы gp 120 также содержит потенциальные CD4-связывающие сайты. Так, два делятационных мутанта белка gp 120 в позиции 62-70 и 116-124 не обладали способностью связываться с CD4. Ряд авторов утверждает, что третья петля белка gp 120 также может вовлекаться в связывание CD4 молекулы. В значительном количестве работ было показано, что продукция Цитокинов является результатом взаимодействия ВИЧ и CD4. Однако топография сайтов CD4 связывающего региона, которые индуцируют цитокины, до сих пор оставалась невыясненной.

Исследования

Мы предприняли попытку расширить перечисленные выше исследования и попытаться показать, какие структуры ВИЧ вовлечены в контакт с CD4. С этой целью участки gp 120, использованные в нашей работе, были представлены
синтетическими пептидами, гомологичными М- и С~концевым регионам и CD4-связывающему сайту. СО4-связывающая активность синтетических пептидов была проанализирована на двух типах CD4 клеток: клона 3G6 трансформированной линии Т-лимфоцитов Jurkat и мононуклеарах периферической крови человека. В проведенном анализе для сравнения (в качестве положительного контроля) использовался рекомбинантный белок gp 120. Были получены данные о том, что различные регионы gpl20 могут участвовать в связывании CD4 молекул, расположенных на лимфоцитах, а возможно и других мононуклеарных. клетках крови. Показано, что пептиды последовательности 426-452,436-451,369-384 и 255-272 связываются с CD4(+) лимфоцитами трансформированной линии Jurkat и мононуклеарами периферической крови. Вероятно, CD4 связывающий регион является гораздо более сложным, чем это было описано в ранних работах, и организован с участием различных доменов, которые при кооперации образуют конформационную структуру на поверхности вируса, которая способствует прикреплению вируса к CD4(+) клеткам крови человека. Эту гипотезу подтверждают данные других исследователей о том, что получаемые структурные нарушения с помощью мутаций CD4 связывающего региона gp 120 приводят к отсутствию контакта между gp 120 и CD4. Этот факт подтверждается нашими данными об исчезновении способности пептида426-452 связываться с CD4 в случае отсутствия двух аминокислот в положении 441 и 442.

По гипотетическому представлению о CD4 связывающем регионе, суммирующем данные литературы и собственные результаты, контакт CD4 молекулы с белком gp 120 происходит в трех регионах: 30-116,250-270, 369-459, - причем за счет использования конформационной структуры петель gp 120 белок вируса и молекула CD4 действуют по принципу "ключ-замок".

Было также интересно выявить, всегда ли связывание пептидов из структуры белка gp 120 приводит к индукции цитокинов, и в случае разобщенности этих функций определить ту часть CD4 связывающего региона белка gp 120, которая способна в клетках -мишенях индуцировать синтез ФНО-а. Это исследование было предпринято в связи с тем, что фактор некроза опухоли играет решающую роль в экспрессии вирусного генома при ВИЧ-инфекции. Экспрессия гена ФНО-а на уровне транскрипции осуществляется через семейство ядерных NF-кВ/ге! факторов. Те же факторы контролируют экспрессию ВИЧ LTR. Показано, что ВИЧ-1,2 напрямую индуцируют продукцию ФНО-а, а обработка ФНО-а инфицированных клеток усиливает процесс репликации вируса в 10 и более раз.

Нами было показано, что дети, больные ВИЧ-инфекцией, имеющие одинаковые сроки от момента инфицирования до момента обследования, со значимо более высокой спонтанной продукцией ФНО-а оказались в более продвинутых стадиях заболевания по сравнению с детьми аналогичного возраста с достоверно более низкой спонтанной продукцией ФНО-амононуклеарами периферической крови.

Представлялось чрезвычайно важным провести анализ ФНО-индуцирующей активности у пептидов, входящих именно в CD4 связывающий регион gp 120,так как продукция ФНО клеткой-мишенью обусловлена взаимодействием CD4 с вирусом. Было показано, что пептид 426-452, связываясь с CD4, индуцирует синтез ФНО-а и белка р24 мононуклеарным и клетками крови пациентов с ВИЧ инфекцией. Делеции двух аминокислот в положении 441-442 приводят к утрате пептидом способности активировать синтез ФНО-а и белка р24. Полученные результаты соответствует данным, которые свидетельствуют, что связывание gp 120 с CD4 приводит к индукции синтеза ФНО-а, что, в свою очередь, способствует репликации вируса, находящегося в "дремлющем" состоянии в клетке. Результаты работы указывают также на то, что не только "классический" CD4 связывающий регион gp 120 вовлекается в контакте CD4+ мононуклеарами и индуцирует синтез ФНО-а, но и другие смежные регионы, представленные в нашей работе пептидами 255-272 и 369-384 из 2 константного и 2 вариабельного регионов. В то же время обнаружен пептид 436-451, способный связываться с CD4 клетками, но не индуцировать ФНО-а. Индукция под воздействием пептида 426-452 в момент его связывания с молекулой CD4 не только ФНО-а, но и ИЛ-lb, ИЛ-6, ИЛ-2 еще раз подчеркивает значение взаимодействия между вирусом и клеткой-мишенью как для дальнейшего размножения вируса, так и инициации того каскада изменений в иммунной системе, который в результате приводит к иммунодефициту при ВИЧ-инфекции.

В 1995-1999 годы был раскрыт еще один механизм проникновения ВИЧ в клетку-хозяина. Оказалось, что рецепторы для хемокинов являются ко-рецепторами для вируса.

Хемокины - это низкомолекулярные молекулы, которые продуцируются, в основном, клетками воспаления (лимфоциты, макрофаги, гранулоциты и эозинофилы) в ответ на стимуляцию антигенами, митогенами и другими активаторами. Они обеспечивают направленное движение клеток, имеющих хемокиновые рецепторы. Этот феномен назван хематтрактацией. Движение обеспечивается взаимодействием хемокина с его рецептором на клетке-мишени. При этом направленность движения клетки происходит за счет увеличивающегося градиента концентрации того или иного хемокина.

Ниже приводятся данные о хемокиновых рецепторах, их лигандах и типах клеток, в которых они преимущественно синтезируются.

Открытию роли хемокиновых рецепторов в качестве корецепторов ВИЧ предшествовали данные о том, что супернатанты культивируемых CD8 клеток обладали ингибирующим действием на инфицирование ВИЧ клеток-мишеней. Поэтому большинство работ было ориентировано на поиски медиаторов, которые по предположению должны синтезироваться CD8 лимфоцитами. В момент написания обзора были открыты ИЛ-16, RANTES, М1Р-1а и М1Р-1Ь, но, судя по интенсивности публикаций на эту тему, следует предполагать открытие новых рецепторов.
Было показано, что хемокиновый рецептор CXCR4 обеспечивает проникновение ВИЧ, тропных к Т-клеткам, CCR2 макрофагам, a CCR3 - к эозинофилам. CCR5 является характерным признаком Т-хелперов 1 типа. Природные лиганды М1Р-1а и RANTES блокируют макрофаг-тропную ВИЧ инфекцию, но не инфекцию, вызванную вирусами, тропными к Т-клеткам. Антитела против М1Р-1а и RANTES способствуют инфицированию клеток ВИЧ.
Показано, что эотаксин прерывает связь вируса с рецептором CCR-3, что указывает на большую роль этого рецептора в патогенезе ВИЧ инфекции.

Однако, эозинофилы, экспрессирующие на поверхности мембраны молекулу CD4, могут быть инфицированы ВИЧ. Лиганд МСР-3 для CCR3 является хематтрактантом для дендритических клеток, которые, будучи инфицированными, играют большую роль в переносе ВИЧ через барьер слизистых оболочек.

Структура, связывающая CCR5, локализуется в регионе, примыкающем к V3 петле. Так при добавлении in vitro растворимого белка CD4 связывание CCR5 с gp 120 увеличивается в 100-1000 раз. Это также свидетельствует о том, что сайт связывания gp 120 формируется после связывания c CD4.

Отмечено, что прогрессия ВИЧ-инфекции связана с переменой используемого корецептора с CCR5 на CXCR4, приводящей к утрате блокирования вируса перечисленными выше хемокинами. Это также ассоциируется с ускоренным снижением числа Т-лимфоцитов и плохим прогнозом заболевания. Причиной этого изменения является мутация в регионе V3 env гена. Помимо этого имеются также нарушения чувствительности вируса к рецептору CCR5, причиной которых являются мутации в V2 регионе.

Роль CCR5 в инфицировании ВИЧ демонстрируется на пациентах-гомозиготах с наличием делеции в 32 положении молекулы CCR5, что ассоциируется с уменьшением, но не абсолютным, риска переноса вируса, снижением вирусной нагрузки и замедленной прогрессией заболевания. Аллель рецептора CCR2-641 ассоциируется со снижением темпа прогрессии заболевания у африканцев, но не у кавказоидов.

Интересно, что генотип SDF-1 ЗА/ЗА, являющийся лигандом CXCR4, связан с ускоренным развитием ВИЧ-инфекции. С другой стороны, у мышей с отсутствием CCR5 рецептора наблюдалась нарушенная функция макрофагов и усиленная активация Т-клеточного иммунитета. Судя по этим данным блокирование хемокиновых рецепторов, помимо прерывания вхождения вируса в клетку, может также активировать противовирусный иммунитет, о чем свидетельствует активация Т-лимфоцитов. Однако, нокаут-мыши с отсутствием CCR2 рецептора имеют дефекты в неспецифической резистентности, что, по-видимому, связано с нарушением рециркуляции макрофагов.

Роль хемокиновых рецепторов в ВИЧ инфицировании подчеркивается рядом работ, в которых использовались модифицированные хемокины для предотвращения связи вируса с клеткой мишенью. Так, рекомбинантные аналоги RANTES обладают большим противовирусным действием. Аминооксипентан-RANTES обладает высокой ингибирующей активностью в отношении инфекционности ВИЧ, имеющих тропность к макрофагам, так как он блокирует рециклирование CCR5. Введение мышам, зараженным ВИЧ, модифицированных форм RANTES приводило к резкому угнетению инфекции, но использование низких доз препарата и других субтипов вируса вызывало парадоксальное усиление инфекции. Были также синтезированы молекулы, связывающие хемокиновые рецепторы. В частности, одной из таких молекул является 1М-а-ацетил-нона-О—аргинин амид, который in vitro блокировал вхождение ВИЧ через CXCR4 рецептор. Сходные по эффекту данные были получены при связывании того же рецептора CXCR4 с использованием синтетического 18-членного пептида.

Представленный материал свидетельствует, что проникновение вируса в клетки организма человека происходит путем связывания оболочечного белка вируса gp 120 с CD4 и хемокиновыми рецепторами. При этом оказывается, что тропизм вируса к различным типам клеток обеспечивается разнообразием хемокиновых рецепторов, которые экспрессированы на их поверхности. Основными ко-рецепторами для ВИЧ являются CXCR4 и CCR5. В процессе ВИЧ-инфекции часто происходит изменение тропизма вируса от CD4 позитивных клеток к макрофагам, что позволяет надеяться на успешное использование модифицированных хемокинов для блокирования ко-рецепторов для ВИЧ.