Материалы медицинских конференций

Главная / Материалы медицинских конференций / 2004 / VΙΙΙ Российский онкологический конгресс

Механизмы регуляции внутриклеточной передачи сигнала и апоптоза: успехи и неудачи целенаправленной терапии

На протяжении последних лет лекарственная терапия злокачественных новообразований переживает свое второе рождение. Стремительное развитие фундаментальной науки выводит лекарственное лечение на качественно иной уровень. Постепенно мы уходим от эмпирического поиска препаратов к рациональному их использованию и лечению тех генетических нарушений, которые ответственны за опухолевую трансформацию и прогрессию. Благодаря более глубокому пониманию механизмов внутриклеточной передачи сигнала и регуляции клеточного цикла мы стали свидетелями создания и появления в клинической практике препаратов целенаправленного действия – так называемых «таргетных» (англ. target – цель, мишень) препаратов.

 

Сигнальные пути являются инструментом, позволяющим клетке правильно реагировать на внешние и внутренние факторы, без чего невозможно биологическое функционирование. Митогенная активность регулируется внешними стимулами (гормоны, цитокины, факторы роста), которые, взаимодействуя с соответствующими рецепторами, расположенными на поверхности клетки, вызывают их димеризацию с аутофосфорилированием внутриклеточных доменов и последующей передачей импульса от рецептора к специальным сигнальным белкам. В результате происходит стимуляция множества пересекающихся сигнальных путей с активацией киназных каскадов, передающих импульс к ядру клетки, и индукцией факторов транскрипции регуляторных генов и циклинзависимых киназ.

 

Приобретение клеткой неопластических свойств характеризуется появлением ряда генетических нарушений, которые приводят к непрерывной и устойчивой стимуляции сигнальных путей, инициирующих клеточную пролиферацию и ряд других биологических эффектов (адгезию, инвазию, ангиогенез). С другой стороны, наблюдается дисфункция со стороны элементов, обеспечивающих контроль клеточного цикла: рост-ингибирующих факторов (TGF-b), ингибиторов циклинзависимых киназ (p21, p16), генов-супрессоров и их белковых продуктов (p53, PTEN, рRb), вызывающих остановку цикла в G1, S, G2 или M фазах или, при необходимости, естественную гибель клетки (апоптоз). Многочисленные элементы сигнальных путей, а также регуляторы клеточного цикла и апоптоза в настоящее время рассматриваются в качестве основных мишеней целенаправленной терапии.

 

Таким образом, принципом «таргетной» терапии является лечение пациентов на основе данных о патогенетических нарушениях, ответственных за опухолевую трансформацию и прогрессию. Исходя из этого, можно сформулировать и основные задачи целенаправленной терапии в онкологии:

 

выделение мишеней, т.е. анормальных сигнальных путей и уровня нарушений в них;

создание лекарственных препаратов, корректирующих данные нарушения;

максимальная индивидуализация терапевтического подхода с помощью молекулярно-генетических методов диагностики, позволяющих выявить мишень (или мишени) у конкретного больного.

Как нормальными, так и опухолевыми клетками экспрессируются различные тирозинкиназные рецепторы, находящиеся на самых верхних этапах сигнальных путей. К ним относят и более 60 разновидностей рецепторов факторов роста, принадлежащих к 20 основным семействам. Активация рецепторов вследствие их гиперэкспрессии, повышенной продукции факторов роста или мутации может приводить к избыточной стимуляции сигнальных путей. Подавление рецепторной активности возможно с помощью как моноклональных антител, так и низкомолекулярных ингибиторов, специфичных к определенному виду рецепторов.

 

Низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназных рецепторов. На сегодняшний день низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназных рецепторов являются одними из наиболее изученных в клиническом отношении таргетных препаратов. Конкурируя с АТФ за АТФ-связывающий внутриклеточный домен тирозинкиназного рецептора, препараты предотвращают фосфорилирование тирозиновых остатков внутриклеточных белков, тем самым блокируя дальнейшую передачу сигнала к ядру клетки.

 

Ярким примером успешного использования низкомолекулярных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ при лечении солидных новообразований является применение иматиниба (Гливек) у больных стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта (GIST). Иматиниб подавляет активность нескольких тирозинкиназных рецепторов (с-KIT, PDGFR) и внутриклеточной мутированной тирозинкиназы Bcr-Abl. До 2000 г. эффективность лекарственного подхода при GIST не превышала 10%, а медиана выживаемости больных с диссеминированным процессом не достигала и 15 мес. Терапия иматинибом в настоящее время позволяет добиться полных и частичных ремиссий в 40-50% случаях, а клинического улучшения у 70-80% больных; 2-летняя выживаемость пациентов уже приблизилась к 73%. Такой успех стал возможен благодаря идентификации ключевого патогенетического механизма, ответственного за развитие GIST, - лиганднезависимой активации рецептора c-KIT вследствие его мутации.

 

При других злокачественных новообразованиях гиперэкспрессия c-KIT опухолевыми клетками не является фактором, определяющим эффективность иматиниба. Так при меланоме и мелкоклеточном раке легкого данный препарат оказался неэффективным, что указывает на наличие иных нарушений в механизмах внутриклеточной передачи сигнала при данных заболеваниях.

 

Другими представителями этого класса препаратов являются ингибиторы семейства рецепторов эпидермального фактора роста, представленного 4 видами: erb1/EGFR, erbB2/HER2-neu, erbB3/HER3 и erbB4/HER4.

 

Данные о гиперэкспрессии EGFR/erb1 целым рядом опухолей эпителиального происхождения (табл. 1), послужили основанием для оценки клинической эффективности двух ингибиторов, специфичных в отношении EGFR: гефитиниба (Иресса), эрлотиниба (Тарцева) (1). Этот подход представлялся весьма рациональным: во-первых, активация тирозинкиназных рецепторов инициирует стимуляцию внутриклеточных сигнальных путей и соответственно пролиферативную активность опухоли; во-вторых, уровень экспрессии EGFR коррелировал с неблагоприятным прогнозом заболевания.

 

В ходе клинических исследований II фазы (табл. 2) была продемонстрирована эффективность данных препаратов в режиме монотерапии у ранее леченных больных немелкоклеточным раком легкого IIIB-IV стадии (2-4). В ходе детального анализа результатов этих исследований, а также последующих рандомизированных исследований, неожиданно появилось много вопросов, которые мы будем обсуждать ниже.

 

Ингибиторы mTOR, raf-киназы, фарнезилтрансферазы. Механизм внутриклеточной передачи сигнала многоэтапный, и клеточные сигнальные пути могут быть активированы на различных уровнях, находящихся ниже тирозинкиназных рецепторов. Чаще всего это происходит в результате мутаций онкогенов, кодирующих или регулирующих соответствующие элементы киназных каскадов: фофатидилинозит-3-киназу (PI3K), митогенактивированную протеинкиназу (MAPK), raf-киназу, ras-белок, PTEN. Вполне логично, что сигнальные пути, стимулированные таким образом, не поддаются коррекции с помощью ингибиторов тирозинкиназных рецепторов. В этих случаях для остановки или ослабления митогенного сигнала могут быть использованы ингибиторы перечисленных выше сигнальных белков.

 

mTOR (мишень рапамицина млекопитающих) принадлежит к семейству киназ, участвующих в передаче сигнала по дистальной части пути PI3K/AKT. Блокада mTOR приводит к подавлению пролиферативного сигнала и остановке клеточного деления в фазе G1. Ингибитором mTOR является CCI-779 - дериват противогрибкового макролида рапамицина. Предпосылками для изучения данного препарата в клинических исследованиях послужили данные о наличии мутации в супрессорном гене PTEN или активирующих мутаций в киназах PI3K и AKT при раке молочной железы, раке почки, немелкоклеточном раке легкого, раке яичников. В ходе исследований II фазы на фоне монотерапии CCI-779 у 6% больных раком молочной железы и раком почки регистрировались полные и частичные регрессии (5, 6). В настоящее время продолжается изучение препарата в рамках III фазы клинических исследований.

 

Ингибиторы raf-киназы предположительно блокируют другой сигнальный путь – ras/raf/MEK/MAPK. К данной группе препаратов принадлежит BAY 43-9006, активность которого изучается в клинических исследованиях II фазы. В режиме монотерапии у 1 из 12 ранее леченных больных диссеминированной меланомой зафиксирована частичная ремиссия и еще у 3 пациентов - стабилизация болезни (7). Предклинические исследования продемонстрировали, что частота активирующих мутаций raf-онкогена при меланоме достигает 70%. В комбинации с карбоплатином и паклитакселом в группе из 35 пациентов в 35% и 54% случаев зарегистрированы частичные ремиссии и стабилизации соответственно (8). Позднее будет проанализирована корреляция статуса raf-киназы в опухоли до начала и в процессе лечения с эффективностью препарата. Но BAY можно отнести к мультитаргетным препаратам, поскольку он блокирует также тирозинкиназые рецепторы васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGFR-2) и фактора роста тромбоцитов (PDGFR-b).

 

Фарнезилирование является неотъемлемой частью процесса активации еще одного элемента того же сигнального пути - ras-белка. Соответственно ингибирование фермента фарнезилтрансферазы способствует сохранению данного белка в неактивной форме. Несмотря на то, что активирующие мутации ras-онкогена наблюдаются у 90% больных раком поджелудочной железы и у 50% раком толстой кишки, ни в одном из клинических исследований при этих заболеваниях не была продемонстрирована эффективность ингибитора фарнезилтрансферазы – типифарниба (R11577, Zarnestra). И в то же время типифарниб оказался эффективным у больных раком молочной железы, при котором ras-мутации встречаются лишь в 20-30% случаев (9). Сейчас данный препарат и его аналоги изучаются в комбинациях с различными химиотерапевтическими режимами при раке молочной железы.

 

Прервать передачу сигнала можно не только за счет прямого ингибирования различных киназ, участвующих в формировании того или иного гиперактивированного внутриклеточного пути, но и за счет подавления их синтеза с помощью олигонуклеотидов.

 

Олигонуклеотиды – уникальная последовательность из 14-16 нуклеотидов, комплементарная определенному участку иРНК. Связываясь с этим участком, они останавливают процесс трансляции и синтеза определенного пептида. Терапия с использованием олигонуклеотидов получила название «антисмысловой». С помощью данного подхода можно блокировать синтез различных сигнальных и регуляторных белков: РKC-a, c-myc, H-ras, bcl-2 и др. Эффективность «антисмысловой» терапии сейчас уточняется во многих клинических исследованиях. В 2003 г. на ASCO были представлены результаты рандомизированного исследования III фазы, в котором изучалась противоопухолевая активность Аффинитака и его роль в химиотерапевтической комбинации паклитаксел + карбоплатин у ранее не леченных больных немелкоклеточным раком легкого. Аффинитак (ISIS3521) является «антисмысловым» олигонуклеотидом, подавляющим синтез протеинкиназы-С (PKC-a) – важнейшего элемента киназных каскадов, передающих импульс от рецепторов факторов роста к ядру клетки, а также участвующего в регуляции механизмов апоптоза. Клинические исследования II фазы продемонстрировали высокую непосредственную эффективность (до 48%) комбинации карбоплатин/паклитаксел + Аффинитак у больных немелкоклеточным раком легкого (10). К сожалению, в следующем рандомизированном исследовании не было выявлено каких-либо преимуществ данной комбинации перед стандартным химиотерапевтическим режимом карбоплатин + паклитаксел (11).

 

В регуляции апоптоза принимает участие более 20 белков семейства BCL2. К ним относятся как белки с антиапоптотическим действием (Bcl-2, Bcl-x, Bcl-G), так и проапоптотические белки (Bax, Bad, Bid и др.). Все они регулируют проницаемость мембраны митохондрий для выхода в цитоплазму цитохрома-С и/или фактора, индуцирующего апоптоз (AIP), которые в свою очередь активируют каспазы, расщепляющие внутриклеточные пептиды. Гиперпродукция bcl-2 как исходная, так и вследствие повреждающего эффекта радиации и цитотоксических агентов, может значительно ослабить действие последних. «Антисмысловые» олигонуклеотиды, блокирующие образование bcl-2, являются объектом для многих клинических исследований. Предклинические данные указывали, что анти-bcl-2 олигонуклеотид (G3139, Генасенс) усиливает противоопухолевую активность многих цитотоксических агентов (дакарбазин, таксаны и др.). Предварительные результаты клинических исследований II-III фазы демонстрируют достоверное увеличение частоты объективных эффектов и времени до прогрессирования у больных диссеминированной меланомой при использовании комбинации Генасенс + дакарбазин в сравнении с монотерапией дакарбазином (12). В другом исследовании комбинация Генасенс + доцетаксел оказалась эффективной у 27% больных гормонорефрактерным раком предстательной железы (13).

 

Пока нам приходится делать выводы об эффективности «таргетного» подхода главным образом на основании данных исследований II фазы. Но уже на этом этапе появились первые сюрпризы. Например, полной неожиданностью была регистрация опухолевых регрессий у пациентов, получавших ингибитор mTOR (CCI-779), который в предклинических исследованиях у животных демонстрировал только цитостатическое действие. Столь же неожиданным было полное фиаско типифарниба при раке толстой кишки и раке поджелудочной железы, при которых у большинства больных идентифицирована потенциальная мишень – мутация ras-онкогена. В то же время у больных раком молочной железы типифарниб оказался эффективным. Это указывает на несовершенство методики отбора препаратов в предклинических исследованиях, в которых существует возможность не заметить эффективный противоопухолевый агент только потому, что он не вызывает полные и/или частичные регрессии на моделях у животных.

 

С другой стороны необходимо более точно определить мишень для «таргетной» терапии и отработать методики, позволяющие убедиться в том, что препарат в выбранных дозах подавляет in vivo соответствующую мишень. Для этого в процессе терапии приходится оценивать изменение активности молекулярной мишени в опухоли или аналогичных мишеней в здоровых тканях: в лимфоцитах крови, костном мозге, тканях кожи.

 

Наибольшее число вопросов появилось после анализа результатов первых крупных рандомизированных плацебо контролируемых клинических исследований, посвященных изучению эффективности низкомолекулярных ингибиторов EGFR (гефитиниба, эрлотиниба) у больных немелкоклеточным раком легкого. Эти исследования не только подтвердили, что эффективность EGFR-ингибиторов не коррелирует с уровнем экспрессии данного вида рецепторов опухолевыми клетками (IDEAL-2), но и доказали нецелесообразность одновременного использования стандартной химиотерапии (гемцитабин + цисплатин или паклитаксел + карбоплатин) и ингибиторов EGFR у больных немелкоклеточным раком легкого (14-17).

 

Существуют несколько версий, объясняющих негативные результаты комбинированной терапии в данных исследованиях. По одной из них при лечении немелкоклеточного рака легкого применение платиносодержащих комбинаций является оптимальным лекарственным подходом, который действует в отношении той же популяции опухолевых клеток, что и ингибиторы EGFR. По другой версии нельзя полностью исключить антагонистическое действие химиотерапии и EGFR-ингибиторов, хотя предклинические исследования доказывали обратное. Известно, что «таргетные» препараты в большей степени обладают антипролиферативным цитостатическим эффектом, когда активность цитотоксической химиотерапия резко падает. Может быть, поэтому возможности цитотоксических агентов не были реализованы в полном объеме.

 

Регистрация клинических и объективных эффектов при отсутствии экспрессии EGFR опухолью может объясняться только наличием других мишеней для действия данных препаратов. Это подтверждается результатами исследования, в котором у пациенток раком молочной железы в процессе монотерапии эрлотинибом наблюдалось изменение активности других генов (более 300) вне зависимости от исходного статуса EGFR (18). Эти гены кодировали компоненты экстрацеллюлярного матрикса, матриксметаллопротеиназу и их ингибиторы, а также различные элементы, участвующие в передаче сигнала.

 

Исследования, посвященные изучению эффективности низкомолекулярных ингибиторов EGFR при немелкоклеточном раке легкого, вскрыли много проблем, требующих решения: необходимость выделения группы больных, для которых данная терапия будет максимально эффективна; определение причин исходной или приобретенной резистентности; оптимальная продолжительность лечения; последовательность химиотерапии и «таргетной» терапии; возможность использования EGFR-ингибиторов при ранних стадиях болезни. Именно в этих направлениях и будут сфокусированы дальнейшие клинические изыскания.

 

Предварительный анализ одного из исследований, результаты которого были представлены в этом году, указывают на то, что наличие активирующих соматических мутаций (делеции и точечные мутации) во внутриклеточном домене рецептора может являться молекулярным маркером, определяющим эффективность монотерапии ингибиторами EGFR у больных немелкоклеточным раком легкого (19). Мутации выявлялись у 8 из 9 больных с зарегистрированным эффектом. При этом медиана выживаемости в этой группе достигла 20 мес. Напротив, у 7 больных, резистентных к гефитинибу, подобные мутации не обнаруживались. Небольшое число наблюдений было обусловлено трудностями в получении гистологического материала на этапе верификации диагноза. В настоящее время выделены и клинические факторы, прогнозирующие эффективность монотерапии гефитинибом и эрлотинибом при немелкоклеточном раке легкого. К ним относят гистологический вариант опухоли, пол, курение в анамнезе. Достоверно чаще регрессии регистрировались при аденокарциномах, включающих также бронхоальвеолярный вариант рака у женщин или у не курящих пациентов (20). Такой негативный прогностический фактор как курение, видимо, приводит к соматическим мутациям, не корректируемым EGFR-ингибиторами. Последующие исследования попытаются ответить на вопрос, существует ли прямая зависимость между представленными выше клиническими факторами прогноза и соматическими мутациями EGFR.

 

Предполагается, что исходная резистентность к терапии низкомолекулярными ингибиторами EGFR может быть обусловлена несколькими причинами. Во-первых, немелкокеточный рак легкого, как и другие злокачественные новообразования, принадлежит к гетерогенным заболеваниям, при которых наблюдаются множественные мутации, что приводит к утере контроля над клеточным циклом и/или к активации различных дистальных элементов сигнальных путей, связанных не только с EGFR, но и с другими рецепторами. Поэтому оправданным выглядит применение либо нескольких таргетных препаратов, воздействующих на различные этапы сигнальных путей, либо мультитаргетного препарата. Во-вторых, в процессе своей активации EGFR/erb1 может образовывать гетеродимер с HER2-neu/erb2, т.е. другим представителем семейства EGFR. И, если этот путь является основным в патогенезе заболевания, пролиферативный сигнал будет более сильным, а ингибиторы, специфичные к EGFR/erb1, не смогут инактивировать гетеродимер erb1/erb2. В данной ситуации целесообразно использовать низкомолекулярный ингибитор, специфичный сразу к двум рецепторам или всем четырем рецепторам семейства EGFR. Такие препараты уже синтезированы (GW572016) и изучаются в рамках клинических исследований II-III фазы у больных раком молочной железы, раком мочевого пузыря. Возможными причинами приобретенной резистентности являются потеря экспрессии рецептора erb1 опухолевыми клетками и/или появление новых мутаций, изменяющих механизм активации того же сигнального пути или приводящих к стимулированию других путей.

 

Одним из удачных примеров эффективного применения «мультитаргетных» препаратов является использование SU11248 при стромальных опухолях желудочно-кишечного тракта, резистентных к иматинибу. SU11248 блокирует тирозинкиназную активность сразу нескольких рецепторов, к которым относятся рецептор васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGFR), фактор роста, выделенного из тромбоцитов, -(PDGFR) и FLT-3. В качестве 2-ой линии терапии данный препарат оказался эффективным у 54% больных GIST (21).

 

Таким образом, механизм внутриклеточной передачи сигнала необходимо рассматривать как сложный комплексный процесс, при котором нарушения могут присутствовать в различных его звеньях. При злокачественных новообразованиях, как правило, не бывает единственного повреждения в сигнальной системе, что еще раз указывает на целесообразность использования «мультитаргетного» подхода.

 

Современные технологии стремительно развиваются, и достижения в области геномики и протеомики в скором времени позволят более точно выделить как гены, так и их белковые продукты, ответственные за те или иные нарушения в сигнальной системе и механизмах контроля клеточного цикла при различных неопластических процессах или в конкретной клинической ситуации. Вполне вероятно, что злокачественные новообразования будут классифицироваться не только по морфологическим признакам, но и по характеру генетических нарушений, поддающихся коррекции с помощью «таргетной» терапии